基因編輯技術(shù)通常指的是利用基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行分子生物學(xué)操作的技術(shù)。這里的基因編輯系統(tǒng)是一大類序列依賴的基因剪切酶的統(tǒng)稱，最廣泛使用為CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中CRISPR全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 意為“成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”；Cas指的是CRISPR-associated, 意為“與CRISPR相關(guān)的（蛋白）”，可以理解為與CRISPR相關(guān)的具備某種或某些（剪切）酶活性的蛋白。由于這個(gè)系統(tǒng)包含CRISPR相關(guān)的剪切蛋白，因此實(shí)現(xiàn)了基因的剪切-拼接，達(dá)到“編輯”的功能，因此，CRISPR也成為了基因編輯技術(shù)的代名詞。

基因編輯的現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于原核生物（細(xì)菌和古生菌）中，是細(xì)菌抵抗病毒的自適應(yīng)免疫系統(tǒng)。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，其原理是細(xì)菌首次被病毒入侵時(shí)，其基因組序列整合了病毒的基因組形成了一段CRISPR，當(dāng)再有外源性的病毒（質(zhì)?；蚴删w）入侵時(shí)，該段CRISPR可以識(shí)別再次入侵的外源DNA，細(xì)菌利用其自身的Cas相關(guān)蛋白切斷外源的基因組變?yōu)榫€性，使得病毒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，最終被細(xì)菌體內(nèi)的酶降解。

基因編輯系統(tǒng)中的CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠“識(shí)別序列”并“剪切”的特性使得其成為基因編輯領(lǐng)域的良好工具，目前已發(fā)現(xiàn)并研究了多種CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，CRISPR/Cas13a等。特別是近幾年發(fā)現(xiàn)的Cas13a，Cas12a等，他們一方面具有識(shí)別并剪切目標(biāo)基因的特性，還具有無(wú)差別剪切DNA/RNA的特性。根據(jù)無(wú)差別剪切DNA/RNA的特性，研究人員將DNA/RNA設(shè)計(jì)成標(biāo)記有熒光報(bào)告基因和猝滅基因的報(bào)告基團(tuán)，當(dāng)用CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a識(shí)別目標(biāo)基因并剪切目標(biāo)基因時(shí)，同時(shí)剪切下來(lái)熒光報(bào)告基因，其釋放的熒光數(shù)和靶基因數(shù)量一致，這樣可以通過(guò)熒光檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)的熒光數(shù)量來(lái)間接檢測(cè)靶基因。該項(xiàng)檢測(cè)通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增及熒光閱讀儀等常規(guī)儀器即可完成，在遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全管理相關(guān)規(guī)定的前提下，應(yīng)用場(chǎng)景廣泛。

目前已有多種有關(guān)IVD檢測(cè)應(yīng)用研究的文章發(fā)表，總結(jié)來(lái)說(shuō)，這類發(fā)表的方法通常先從人體樣本中提取目標(biāo)核酸（如病毒的DNA或RNA），Cas經(jīng)過(guò)一段先導(dǎo)RNA（gRNA, guide RNA）的設(shè)計(jì)引導(dǎo)其配對(duì)至目標(biāo)核酸序列位置，通過(guò)RPA（Recombinase Polymerase Amplification，重組酶聚合酶擴(kuò)增）擴(kuò)增（一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，最佳反應(yīng)溫度37℃）放大其中目標(biāo)基因的濃度，隨后采用基因編輯技術(shù)進(jìn)行剪切并釋放熒光信號(hào)，進(jìn)而對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。例一，采用CRISPR/Cas12a識(shí)別單鏈DNA開(kāi)發(fā)的檢測(cè)人體樣本中人乳頭瘤病毒HPV 16和18的試劑，也叫做DETECTR（ DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）；例二，國(guó)外的張峰團(tuán)隊(duì)結(jié)合前期研究開(kāi)發(fā)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）方法，該方法基于Cas13a酶，采用RPA擴(kuò)增技術(shù)和RNA引導(dǎo)Cas13a進(jìn)行信號(hào)剪切，該技術(shù)熒光信號(hào)是連接在RNA上的，利用Cas13酶的附帶的無(wú)差別剪切RNA的功能，實(shí)現(xiàn)信號(hào)釋放，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為開(kāi)發(fā)產(chǎn)品的難點(diǎn)在于提取純化Cas13；例三，其他團(tuán)隊(duì)采用另外一種更簡(jiǎn)便快速的樣本處理方式HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）處理諸如咽拭子、唾液、尿液等樣本并結(jié)合SHERLOCK方法，已證實(shí)可以很好地檢出如寨卡病毒、登革病毒、黃病毒等RNA病毒，由于HUDSON僅是通過(guò)加熱免提取處理臨床唾液或尿液樣本，拋開(kāi)了繁復(fù)的核酸提取過(guò)程，今后有望應(yīng)用于POCT現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，或可供WHO采購(gòu)用在實(shí)驗(yàn)條件有限的國(guó)家和地區(qū)；例四，還有團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了用于人基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP，single nucleotide polymorphism）的檢測(cè)方法等。

新冠病毒同屬于RNA病毒，自去年疫情暴發(fā)以來(lái)， FDA 在2020年5月EUA（for Emergency Use Authorization only，僅限于緊急授權(quán)使用）首次批準(zhǔn)了張峰團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的基因編輯IVD產(chǎn)品——SHERLOCK方法學(xué)定性檢測(cè)人體上呼吸道樣本中的新冠病毒N基因和ORF1ab基因，從檢索批準(zhǔn)文件和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上看，該產(chǎn)品是一個(gè)僅限在實(shí)驗(yàn)室使用而非可以廣泛使用的產(chǎn)品，需要采用Thermo公司的RNA提取試劑盒嚴(yán)格地進(jìn)行核酸提取純化步驟來(lái)完成，并非如文獻(xiàn)報(bào)道的那樣采用加熱免提取來(lái)處理臨床樣本如唾液、咽拭子等。分析性能方面，該產(chǎn)品最低檢出限N基因?yàn)?.35copies/ul VTM，ORF1ab基因?yàn)?.75copies/ul VTM，整個(gè)從提取至檢測(cè)出結(jié)果時(shí)間不超過(guò)2小時(shí)。

國(guó)內(nèi)目前已有進(jìn)入優(yōu)先/應(yīng)急審評(píng)的國(guó)產(chǎn)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測(cè)產(chǎn)品中，已批準(zhǔn)的產(chǎn)品2個(gè)，處于溝通交流及資料完善中的產(chǎn)品1個(gè)，從現(xiàn)有資料看，采用的基因編輯系統(tǒng)一種為國(guó)內(nèi)廠商使用的CRISPR/Cas13a以及Cas12a系統(tǒng)，與國(guó)際研究相符，因?yàn)镃as13或Cas12除了靶向剪切目標(biāo)核酸序列外，還附帶有無(wú)差別剪切核酸信號(hào)的功能。另外，國(guó)內(nèi)廠商都是通過(guò)外購(gòu)獲得Cas13a和Cas12a這兩種剪切蛋白，并未具有自行制備的能力。第二種為有自己自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的科研院所和企業(yè)合作，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測(cè)產(chǎn)品，比如中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪院士團(tuán)隊(duì)，其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系統(tǒng)，該系統(tǒng)是我國(guó)自主研發(fā)并申請(qǐng)了國(guó)際、國(guó)內(nèi)專利，目前產(chǎn)品已完成注冊(cè)檢驗(yàn)，處于溝通交流及資料完善階段。目前國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品從批準(zhǔn)和完成的注冊(cè)檢驗(yàn)的情況來(lái)看，可以滿足新冠病毒國(guó)家參考品和臨床使用的要求，根據(jù)產(chǎn)品不同，最低檢出限在450copies～1000copies左右。

從CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)到臨床實(shí)踐的應(yīng)用及探索，除了最初帶給人類上帝之手的驚喜之外，研究人員逐漸認(rèn)識(shí)到了該系統(tǒng)家族應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn)，目前仍在不斷地進(jìn)行改造和應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，隨著近年Cas13及Cas12的發(fā)現(xiàn)，相較早先的Cas9基因編輯系統(tǒng)具有更好的準(zhǔn)確性，解決了脫靶效應(yīng)（即未嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)要求剪切）問(wèn)題，同時(shí)其附帶的無(wú)差別剪切功能契合了體外診斷中需要釋放檢測(cè)信號(hào)的需求，總體來(lái)說(shuō)CRISPR應(yīng)用到IVD是一個(gè)劃時(shí)代的發(fā)現(xiàn)，可以稱作是新的診斷技術(shù)，其精準(zhǔn)性和快速性逐漸得到了科研人員的認(rèn)可。

準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)一直是IVD開(kāi)發(fā)的目標(biāo)，但就目前已在臨床應(yīng)用的產(chǎn)品來(lái)看，CRISPR技術(shù)和傳統(tǒng)的成熟PCR相比還未顯現(xiàn)明顯優(yōu)勢(shì)，PCR的最低檢出限和檢測(cè)速度甚至可以超越CRISPR。一個(gè)新技術(shù)需要一定時(shí)間的成熟和發(fā)展，也需要越來(lái)越多的臨床應(yīng)用反饋來(lái)改進(jìn)，因此，隨著提取技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用以及更新更好的Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)，CRISPR技術(shù)是否能超越傳統(tǒng)PCR，是否如發(fā)表文獻(xiàn)所說(shuō)的有專屬的應(yīng)用場(chǎng)景還有待觀察。

審評(píng)關(guān)注點(diǎn)：gRNA設(shè)計(jì)，靶序列的識(shí)別信號(hào)剪切的驗(yàn)證與對(duì)應(yīng)關(guān)系，脫靶效應(yīng)，最低檢出限，檢測(cè)所需時(shí)間等。

注：

1.基因編輯診斷產(chǎn)品的擴(kuò)增方式多采用等溫?cái)U(kuò)增，除采用RPA外，還常采用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）和RAA（Recombinase Aided Amplification，重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）。

2.有報(bào)道Cas12a的無(wú)差別剪切活性激活在gRNA與靶序列配對(duì)時(shí)就發(fā)生了，并不依賴與靶序列是否切割。

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[5] SHERLOCK官網(wǎng)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)：https://sherlock.bio/wp-content/uploads/2020/06/EUA200466-Sherlock-IFU-_FDA-Authorized-Copy_-05062020-FINAL-Copy3.pdf

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轉(zhuǎn)載：器審中心  審評(píng)六部 陳亭亭