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基因編輯技術(shù)及相關(guān)IVD產(chǎn)品簡(jiǎn)介

瀏覽次數(shù):5660+ 發(fā)布時(shí)間:2023-05-24

基因編輯技術(shù)通常指的是利用基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行分子生物學(xué)操作的技術(shù)。這里的基因編輯系統(tǒng)是一大類序列依賴的基因剪切酶的統(tǒng)稱,最廣泛使用為CRISPR/Cas系統(tǒng),其中CRISPR全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 意為“成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”;Cas指的是CRISPR-associated, 意為“與CRISPR相關(guān)的(蛋白)”,可以理解為與CRISPR相關(guān)的具備某種或某些(剪切)酶活性的蛋白。由于這個(gè)系統(tǒng)包含CRISPR相關(guān)的剪切蛋白,因此實(shí)現(xiàn)了基因的剪切-拼接,達(dá)到“編輯”的功能,因此,CRISPR也成為了基因編輯技術(shù)的代名詞。


基因編輯的現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于原核生物(細(xì)菌和古生菌)中,是細(xì)菌抵抗病毒的自適應(yīng)免疫系統(tǒng)。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō),其原理是細(xì)菌首次被病毒入侵時(shí),其基因組序列整合了病毒的基因組形成了一段CRISPR,當(dāng)再有外源性的病毒(質(zhì)?;蚴删w)入侵時(shí),該段CRISPR可以識(shí)別再次入侵的外源DNA,細(xì)菌利用其自身的Cas相關(guān)蛋白切斷外源的基因組變?yōu)榫€性,使得病毒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá),最終被細(xì)菌體內(nèi)的酶降解。


基因編輯系統(tǒng)中的CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠“識(shí)別序列”并“剪切”的特性使得其成為基因編輯領(lǐng)域的良好工具,目前已發(fā)現(xiàn)并研究了多種CRISPR/Cas系統(tǒng),包括CRISPR/Cas9,CRISPR/Cas12a,CRISPR/Cas13a等。特別是近幾年發(fā)現(xiàn)的Cas13a,Cas12a等,他們一方面具有識(shí)別并剪切目標(biāo)基因的特性,還具有無(wú)差別剪切DNA/RNA的特性。根據(jù)無(wú)差別剪切DNA/RNA的特性,研究人員將DNA/RNA設(shè)計(jì)成標(biāo)記有熒光報(bào)告基因和猝滅基因的報(bào)告基團(tuán),當(dāng)用CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a識(shí)別目標(biāo)基因并剪切目標(biāo)基因時(shí),同時(shí)剪切下來(lái)熒光報(bào)告基因,其釋放的熒光數(shù)和靶基因數(shù)量一致,這樣可以通過(guò)熒光檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)的熒光數(shù)量來(lái)間接檢測(cè)靶基因。該項(xiàng)檢測(cè)通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增及熒光閱讀儀等常規(guī)儀器即可完成,在遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全管理相關(guān)規(guī)定的前提下,應(yīng)用場(chǎng)景廣泛。


目前已有多種有關(guān)IVD檢測(cè)應(yīng)用研究的文章發(fā)表,總結(jié)來(lái)說(shuō),這類發(fā)表的方法通常先從人體樣本中提取目標(biāo)核酸(如病毒的DNA或RNA),Cas經(jīng)過(guò)一段先導(dǎo)RNA(gRNA, guide RNA)的設(shè)計(jì)引導(dǎo)其配對(duì)至目標(biāo)核酸序列位置,通過(guò)RPA(Recombinase Polymerase Amplification,重組酶聚合酶擴(kuò)增)擴(kuò)增(一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),最佳反應(yīng)溫度37℃)放大其中目標(biāo)基因的濃度,隨后采用基因編輯技術(shù)進(jìn)行剪切并釋放熒光信號(hào),進(jìn)而對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。例一,采用CRISPR/Cas12a識(shí)別單鏈DNA開(kāi)發(fā)的檢測(cè)人體樣本中人乳頭瘤病毒HPV 16和18的試劑,也叫做DETECTR( DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter);例二,國(guó)外的張峰團(tuán)隊(duì)結(jié)合前期研究開(kāi)發(fā)了SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)方法,該方法基于Cas13a酶,采用RPA擴(kuò)增技術(shù)和RNA引導(dǎo)Cas13a進(jìn)行信號(hào)剪切,該技術(shù)熒光信號(hào)是連接在RNA上的,利用Cas13酶的附帶的無(wú)差別剪切RNA的功能,實(shí)現(xiàn)信號(hào)釋放,該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為開(kāi)發(fā)產(chǎn)品的難點(diǎn)在于提取純化Cas13;例三,其他團(tuán)隊(duì)采用另外一種更簡(jiǎn)便快速的樣本處理方式HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)處理諸如咽拭子、唾液、尿液等樣本并結(jié)合SHERLOCK方法,已證實(shí)可以很好地檢出如寨卡病毒、登革病毒、黃病毒等RNA病毒,由于HUDSON僅是通過(guò)加熱免提取處理臨床唾液或尿液樣本,拋開(kāi)了繁復(fù)的核酸提取過(guò)程,今后有望應(yīng)用于POCT現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),或可供WHO采購(gòu)用在實(shí)驗(yàn)條件有限的國(guó)家和地區(qū);例四,還有團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了用于人基因組單核苷酸多態(tài)性(SNP,single nucleotide polymorphism)的檢測(cè)方法等。


新冠病毒同屬于RNA病毒,自去年疫情暴發(fā)以來(lái), FDA 在2020年5月EUA(for Emergency Use Authorization only,僅限于緊急授權(quán)使用)首次批準(zhǔn)了張峰團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的基因編輯IVD產(chǎn)品——SHERLOCK方法學(xué)定性檢測(cè)人體上呼吸道樣本中的新冠病毒N基因和ORF1ab基因,從檢索批準(zhǔn)文件和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上看,該產(chǎn)品是一個(gè)僅限在實(shí)驗(yàn)室使用而非可以廣泛使用的產(chǎn)品,需要采用Thermo公司的RNA提取試劑盒嚴(yán)格地進(jìn)行核酸提取純化步驟來(lái)完成,并非如文獻(xiàn)報(bào)道的那樣采用加熱免提取來(lái)處理臨床樣本如唾液、咽拭子等。分析性能方面,該產(chǎn)品最低檢出限N基因?yàn)?.35copies/ul VTM,ORF1ab基因?yàn)?.75copies/ul VTM,整個(gè)從提取至檢測(cè)出結(jié)果時(shí)間不超過(guò)2小時(shí)。


國(guó)內(nèi)目前已有進(jìn)入優(yōu)先/應(yīng)急審評(píng)的國(guó)產(chǎn)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測(cè)產(chǎn)品中,已批準(zhǔn)的產(chǎn)品2個(gè),處于溝通交流及資料完善中的產(chǎn)品1個(gè),從現(xiàn)有資料看,采用的基因編輯系統(tǒng)一種為國(guó)內(nèi)廠商使用的CRISPR/Cas13a以及Cas12a系統(tǒng),與國(guó)際研究相符,因?yàn)镃as13或Cas12除了靶向剪切目標(biāo)核酸序列外,還附帶有無(wú)差別剪切核酸信號(hào)的功能。另外,國(guó)內(nèi)廠商都是通過(guò)外購(gòu)獲得Cas13a和Cas12a這兩種剪切蛋白,并未具有自行制備的能力。第二種為有自己自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的科研院所和企業(yè)合作,轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測(cè)產(chǎn)品,比如中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪院士團(tuán)隊(duì),其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系統(tǒng),該系統(tǒng)是我國(guó)自主研發(fā)并申請(qǐng)了國(guó)際、國(guó)內(nèi)專利,目前產(chǎn)品已完成注冊(cè)檢驗(yàn),處于溝通交流及資料完善階段。目前國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品從批準(zhǔn)和完成的注冊(cè)檢驗(yàn)的情況來(lái)看,可以滿足新冠病毒國(guó)家參考品和臨床使用的要求,根據(jù)產(chǎn)品不同,最低檢出限在450copies~1000copies左右。


從CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)到臨床實(shí)踐的應(yīng)用及探索,除了最初帶給人類上帝之手的驚喜之外,研究人員逐漸認(rèn)識(shí)到了該系統(tǒng)家族應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn),目前仍在不斷地進(jìn)行改造和應(yīng)用于不同的領(lǐng)域,隨著近年Cas13及Cas12的發(fā)現(xiàn),相較早先的Cas9基因編輯系統(tǒng)具有更好的準(zhǔn)確性,解決了脫靶效應(yīng)(即未嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)要求剪切)問(wèn)題,同時(shí)其附帶的無(wú)差別剪切功能契合了體外診斷中需要釋放檢測(cè)信號(hào)的需求,總體來(lái)說(shuō)CRISPR應(yīng)用到IVD是一個(gè)劃時(shí)代的發(fā)現(xiàn),可以稱作是新的診斷技術(shù),其精準(zhǔn)性和快速性逐漸得到了科研人員的認(rèn)可。


準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)一直是IVD開(kāi)發(fā)的目標(biāo),但就目前已在臨床應(yīng)用的產(chǎn)品來(lái)看,CRISPR技術(shù)和傳統(tǒng)的成熟PCR相比還未顯現(xiàn)明顯優(yōu)勢(shì),PCR的最低檢出限和檢測(cè)速度甚至可以超越CRISPR。一個(gè)新技術(shù)需要一定時(shí)間的成熟和發(fā)展,也需要越來(lái)越多的臨床應(yīng)用反饋來(lái)改進(jìn),因此,隨著提取技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用以及更新更好的Cas蛋白的發(fā)現(xiàn),CRISPR技術(shù)是否能超越傳統(tǒng)PCR,是否如發(fā)表文獻(xiàn)所說(shuō)的有專屬的應(yīng)用場(chǎng)景還有待觀察。


審評(píng)關(guān)注點(diǎn):gRNA設(shè)計(jì),靶序列的識(shí)別信號(hào)剪切的驗(yàn)證與對(duì)應(yīng)關(guān)系,脫靶效應(yīng),最低檢出限,檢測(cè)所需時(shí)間等。


注:


1.基因編輯診斷產(chǎn)品的擴(kuò)增方式多采用等溫?cái)U(kuò)增,除采用RPA外,還常采用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)和RAA(Recombinase Aided Amplification,重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)。


2.有報(bào)道Cas12a的無(wú)差別剪切活性激活在gRNA與靶序列配對(duì)時(shí)就發(fā)生了,并不依賴與靶序列是否切割。

 

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[4] FDA網(wǎng)站EUA查詢:產(chǎn)品名稱:Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit, 2020 May 6,https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas

[5] SHERLOCK官網(wǎng)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū):https://sherlock.bio/wp-content/uploads/2020/06/EUA200466-Sherlock-IFU-_FDA-Authorized-Copy_-05062020-FINAL-Copy3.pdf

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[7] Fei Teng, Lu Guo, Tongtong Cui, Xin-Ge Wang, Kai Xu, Qingqin Gao, Qi Zhou and Wei Li,CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity, Genome Biology (2019)20:132.

轉(zhuǎn)載:器審中心  審評(píng)六部 陳亭亭