基因編輯技術(shù)通常指的是利用基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行分子生物學(xué)操作的技術(shù)。這里的基因編輯系統(tǒng)是一大類序列依賴的基因剪切酶的統(tǒng)稱，最廣泛使用為CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中CRISPR全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 意為“成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”；Cas指的是CRISPR-associated, 意為“與CRISPR相關(guān)的（蛋白）”，可以理解為與CRISPR相關(guān)的具備某種或某些（剪切）酶活性的蛋白。由于這個系統(tǒng)包含CRISPR相關(guān)的剪切蛋白，因此實現(xiàn)了基因的剪切-拼接，達(dá)到“編輯”的功能，因此，CRISPR也成為了基因編輯技術(shù)的代名詞。

基因編輯的現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于原核生物（細(xì)菌和古生菌）中，是細(xì)菌抵抗病毒的自適應(yīng)免疫系統(tǒng)。簡要來說，其原理是細(xì)菌首次被病毒入侵時，其基因組序列整合了病毒的基因組形成了一段CRISPR，當(dāng)再有外源性的病毒（質(zhì)?；蚴删w）入侵時，該段CRISPR可以識別再次入侵的外源DNA，細(xì)菌利用其自身的Cas相關(guān)蛋白切斷外源的基因組變?yōu)榫€性，使得病毒無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，最終被細(xì)菌體內(nèi)的酶降解。

基因編輯系統(tǒng)中的CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠“識別序列”并“剪切”的特性使得其成為基因編輯領(lǐng)域的良好工具，目前已發(fā)現(xiàn)并研究了多種CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，CRISPR/Cas13a等。特別是近幾年發(fā)現(xiàn)的Cas13a，Cas12a等，他們一方面具有識別并剪切目標(biāo)基因的特性，還具有無差別剪切DNA/RNA的特性。根據(jù)無差別剪切DNA/RNA的特性，研究人員將DNA/RNA設(shè)計成標(biāo)記有熒光報告基因和猝滅基因的報告基團(tuán)，當(dāng)用CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a識別目標(biāo)基因并剪切目標(biāo)基因時，同時剪切下來熒光報告基因，其釋放的熒光數(shù)和靶基因數(shù)量一致，這樣可以通過熒光檢測設(shè)備檢測的熒光數(shù)量來間接檢測靶基因。該項檢測通過等溫擴(kuò)增及熒光閱讀儀等常規(guī)儀器即可完成，在遵循實驗室生物安全管理相關(guān)規(guī)定的前提下，應(yīng)用場景廣泛。

目前已有多種有關(guān)IVD檢測應(yīng)用研究的文章發(fā)表，總結(jié)來說，這類發(fā)表的方法通常先從人體樣本中提取目標(biāo)核酸（如病毒的DNA或RNA），Cas經(jīng)過一段先導(dǎo)RNA（gRNA, guide RNA）的設(shè)計引導(dǎo)其配對至目標(biāo)核酸序列位置，通過RPA（Recombinase Polymerase Amplification，重組酶聚合酶擴(kuò)增）擴(kuò)增（一種等溫擴(kuò)增技術(shù)，最佳反應(yīng)溫度37℃）放大其中目標(biāo)基因的濃度，隨后采用基因編輯技術(shù)進(jìn)行剪切并釋放熒光信號，進(jìn)而對熒光信號進(jìn)行檢測。例一，采用CRISPR/Cas12a識別單鏈DNA開發(fā)的檢測人體樣本中人乳頭瘤病毒HPV 16和18的試劑，也叫做DETECTR（ DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）；例二，國外的張峰團(tuán)隊結(jié)合前期研究開發(fā)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）方法，該方法基于Cas13a酶，采用RPA擴(kuò)增技術(shù)和RNA引導(dǎo)Cas13a進(jìn)行信號剪切，該技術(shù)熒光信號是連接在RNA上的，利用Cas13酶的附帶的無差別剪切RNA的功能，實現(xiàn)信號釋放，該團(tuán)隊認(rèn)為開發(fā)產(chǎn)品的難點在于提取純化Cas13；例三，其他團(tuán)隊采用另外一種更簡便快速的樣本處理方式HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）處理諸如咽拭子、唾液、尿液等樣本并結(jié)合SHERLOCK方法，已證實可以很好地檢出如寨卡病毒、登革病毒、黃病毒等RNA病毒，由于HUDSON僅是通過加熱免提取處理臨床唾液或尿液樣本，拋開了繁復(fù)的核酸提取過程，今后有望應(yīng)用于POCT現(xiàn)場檢測，或可供WHO采購用在實驗條件有限的國家和地區(qū)；例四，還有團(tuán)隊開發(fā)了用于人基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP，single nucleotide polymorphism）的檢測方法等。

新冠病毒同屬于RNA病毒，自去年疫情暴發(fā)以來， FDA 在2020年5月EUA（for Emergency Use Authorization only，僅限于緊急授權(quán)使用）首次批準(zhǔn)了張峰團(tuán)隊開發(fā)的基因編輯IVD產(chǎn)品——SHERLOCK方法學(xué)定性檢測人體上呼吸道樣本中的新冠病毒N基因和ORF1ab基因，從檢索批準(zhǔn)文件和產(chǎn)品說明書上看，該產(chǎn)品是一個僅限在實驗室使用而非可以廣泛使用的產(chǎn)品，需要采用Thermo公司的RNA提取試劑盒嚴(yán)格地進(jìn)行核酸提取純化步驟來完成，并非如文獻(xiàn)報道的那樣采用加熱免提取來處理臨床樣本如唾液、咽拭子等。分析性能方面，該產(chǎn)品最低檢出限N基因為1.35copies/ul VTM，ORF1ab基因為6.75copies/ul VTM，整個從提取至檢測出結(jié)果時間不超過2小時。

國內(nèi)目前已有進(jìn)入優(yōu)先/應(yīng)急審評的國產(chǎn)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測產(chǎn)品中，已批準(zhǔn)的產(chǎn)品2個，處于溝通交流及資料完善中的產(chǎn)品1個，從現(xiàn)有資料看，采用的基因編輯系統(tǒng)一種為國內(nèi)廠商使用的CRISPR/Cas13a以及Cas12a系統(tǒng)，與國際研究相符，因為Cas13或Cas12除了靶向剪切目標(biāo)核酸序列外，還附帶有無差別剪切核酸信號的功能。另外，國內(nèi)廠商都是通過外購獲得Cas13a和Cas12a這兩種剪切蛋白，并未具有自行制備的能力。第二種為有自己自主知識產(chǎn)權(quán)的科研院所和企業(yè)合作，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因編輯方法學(xué)的新冠病毒檢測產(chǎn)品，比如中國科學(xué)院動物研究所周琪院士團(tuán)隊，其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系統(tǒng)，該系統(tǒng)是我國自主研發(fā)并申請了國際、國內(nèi)專利，目前產(chǎn)品已完成注冊檢驗，處于溝通交流及資料完善階段。目前國產(chǎn)產(chǎn)品從批準(zhǔn)和完成的注冊檢驗的情況來看，可以滿足新冠病毒國家參考品和臨床使用的要求，根據(jù)產(chǎn)品不同，最低檢出限在450copies～1000copies左右。

從CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)到臨床實踐的應(yīng)用及探索，除了最初帶給人類上帝之手的驚喜之外，研究人員逐漸認(rèn)識到了該系統(tǒng)家族應(yīng)用的優(yōu)、缺點，目前仍在不斷地進(jìn)行改造和應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，隨著近年Cas13及Cas12的發(fā)現(xiàn)，相較早先的Cas9基因編輯系統(tǒng)具有更好的準(zhǔn)確性，解決了脫靶效應(yīng)（即未嚴(yán)格按照設(shè)計要求剪切）問題，同時其附帶的無差別剪切功能契合了體外診斷中需要釋放檢測信號的需求，總體來說CRISPR應(yīng)用到IVD是一個劃時代的發(fā)現(xiàn)，可以稱作是新的診斷技術(shù)，其精準(zhǔn)性和快速性逐漸得到了科研人員的認(rèn)可。

準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)一直是IVD開發(fā)的目標(biāo)，但就目前已在臨床應(yīng)用的產(chǎn)品來看，CRISPR技術(shù)和傳統(tǒng)的成熟PCR相比還未顯現(xiàn)明顯優(yōu)勢，PCR的最低檢出限和檢測速度甚至可以超越CRISPR。一個新技術(shù)需要一定時間的成熟和發(fā)展，也需要越來越多的臨床應(yīng)用反饋來改進(jìn)，因此，隨著提取技術(shù)、等溫擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用以及更新更好的Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)，CRISPR技術(shù)是否能超越傳統(tǒng)PCR，是否如發(fā)表文獻(xiàn)所說的有專屬的應(yīng)用場景還有待觀察。

審評關(guān)注點：gRNA設(shè)計，靶序列的識別信號剪切的驗證與對應(yīng)關(guān)系，脫靶效應(yīng)，最低檢出限，檢測所需時間等。

注：

1.基因編輯診斷產(chǎn)品的擴(kuò)增方式多采用等溫擴(kuò)增，除采用RPA外，還常采用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增）和RAA（Recombinase Aided Amplification，重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增）。

2.有報道Cas12a的無差別剪切活性激活在gRNA與靶序列配對時就發(fā)生了，并不依賴與靶序列是否切割。

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[4] FDA網(wǎng)站EUA查詢：產(chǎn)品名稱：Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit, 2020 May 6，https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas

[5] SHERLOCK官網(wǎng)產(chǎn)品說明書：https://sherlock.bio/wp-content/uploads/2020/06/EUA200466-Sherlock-IFU-_FDA-Authorized-Copy_-05062020-FINAL-Copy3.pdf

[6] Lu Guo, Xuehan Sun, Xinge Wang, Chen Liang, Haiping Jiang, Qingqin Gao, Moyu Dai, Bin Qu, Sen Fang, Yihuan Mao, Yangcan Chen, Guihai Feng, Qi Gu, Ruiqi Rachel Wang, Qi Zhou and Wei Li，SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics，Cell Discoverry (2020)6:34.

[7] Fei Teng, Lu Guo, Tongtong Cui, Xin-Ge Wang, Kai Xu, Qingqin Gao, Qi Zhou and Wei Li,CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity, Genome Biology (2019)20:132.

轉(zhuǎn)載：器審中心  審評六部 陳亭亭